CHO细胞的江湖

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作者简介

韩向宗，博士，默克生物工艺部分上游研发中国区负责人，负责细胞株开辟、定制化培育基开辟及进程工艺开辟，涵盖大份子生物制造和疫苗行业。韩博士在生物制造行业有跨越15年的从业经历，出格是在基于CHO细胞的重组卵白表达平台具有丰富的经历。在加入默克之前，韩博士在中国第一家专注于生物制药的CRO公司中美奥达任上游研发总监，并带领了数十个项目标开辟。韩博士结业于山东大学生命科学系，以后在中国科学院上海生命科学院获得生物医药博士学位。

哺乳动物细胞具有和人类类似的复杂翻译后修饰，常被用来表达具有活性的生物大份子卵白。而这些生物大份子的功用发挥在一定水平上依靠于这些翻译后修饰。3T3，BHK，293，CHO，NS0，Hela等细胞均被研讨并用作生物大份子卵白的表达，可是有近70%已经上市的治疗性卵白是由CHO细胞表达生产的，CHO细胞已经成为需要复杂翻译后修饰的治疗性卵白生产的首要工具。这首要得益于CHO细胞的以下一些特点：1）具有和人类似的翻译后修饰；2）清楚的历史布景和监管机构的认可；3）较少的排泄性内源卵白；4）在无血清及化学限制培育基中快速妥当的悬浮发展；5）病毒平安性; 6) 四十多年来堆集的常识和经历。随着近些年在细胞工程及细胞培育基以及工艺开辟方面的明显停顿，CHO细胞的表达量获得了很是明显的进步，跨越10g/L的流加培育工艺及25g/L的稀释灌流培育工艺常见于学术期刊和会议报告。

CHO历史及品种

CHO细胞最早由Puck尝试室在1957年分手，经过将0.1g中国仓鼠卵巢构造酶解消化获得。酶解后大部分细胞属于成纤维细胞，在停止跨越10个月的体外培育后，细胞并未表示出普通二倍体细胞的Hayflick界限，仍然可以继续割裂发展，可是细胞形状从最初的成纤维细胞转酿成近上皮细胞的形状。1958年Puke尝试室将此持续传代细胞停止重新克隆后，建立了我们现在所用的CHO细胞最原始细胞系。这个最原始的CHO细胞系是脯氨酸缺点型的，必须在培育基中增加额外的脯氨酸以支持其发展，今朝一切已知的CHO细胞系均保存了这个特征。这个最原始的CHO细胞系后来流转到分歧的尝试室和公司，经过度歧的培育、驯化、革新和重新克隆后构成了分歧品种的CHO细胞系。这些细胞系虽然都是来历于最原始的CHO细胞系，但由于CHO细胞基因组内在的不稳定性及后续分歧尝试室的挑选培育条件分歧，分歧CHO细胞系之间的形状、发展、表达、代谢、甚至基因组都有较大差别，下面就几种常用的CHO细胞系停止描写。

CHO-K1
CHO-K1是未经革新的野生型CHO细胞。最初的CHO-K1是在1970年左右，由Puck和Kao的尝试室将原始CHO细胞系的一个亚克隆寄存于ATCC（CCL-61），并命名。随后源于ATCC CHO-K1的一个亚克隆在1985年被分手，并保存于ECACC（85051005），并被制药公司和CMO公司用作重组卵白的表达。最原始的CHO-K1细胞是贴壁培育，并需要增加血清，由于血清的批间稳定性题目，及后来病毒平安性题目，无血清悬浮培育成为趋向。其中Lonza公司从ECACC获得CHO-K1驯化到悬浮无血清培育后，建立CHO K1 SV（Lonza，2002）细胞株，并普遍利用于其GS表达平台。Merck（原SAFC）也是从ECACC获得CHO-K1细胞株，并悬浮驯化至化学成份限制培育基中，构成了CHOZN® CHO K1（Merck，2022）细胞株。

基于CHO-K1细胞的表达平台多采用GS（谷氨酰胺分解酶）挑选系统和/或抗生素挑选系统。采用GS挑选系统的平台可在转入目标卵白基因的同时转入GS基因，在挑选阶段采用不含谷氨酰胺的培育基停止挑选。但由于CHO-K1细胞具有内源的GS基因，是以在挑选时常常需要增加MSX甚至和一定量的抗生素同时挑选，以进步挑选效力。此外，由于内源GS基因的存在，挑选出的高表达克隆常常稳定性较差，需要停止充实的稳定性评价后，方可用于前期的工艺开辟及范围化生产。而零丁采用抗生素停止挑选的平台，因挑选效力较低，多用于研讨阶段。今朝多个已经上市的治疗性卵白是基于CHO-K1细胞停止开辟生产的。

CHO-S
基于原始的CHO细胞系，1973年Thompson尝试室分手了一株可用于悬浮培育的CHO细胞，并将此细胞命名为CHO-S。虽然都来历于最原始的CHO细胞系，但从细胞历史分枝上看，CHO-S和CHO-K1分属于分歧的代系。此细胞系在1980年月前期供给给那时的Gibco公司，后者将此细胞驯化至CD CHO培育基中，建库并以CHO-S称号停止推行。因其能在无血清培育基中悬浮发展，并支持高密度培育，在早期常被用作瞬时表达宿主细胞。尔后，响应的GMP细胞库被建立，并支持贸易化授权开辟。

CHO-DXB11
CHO-DXB11（别名DUK-XB11）是由哥伦比亚大学的Urlaub和Chasin在1970-80年月经过伽马射线诱变的方式获得。CHO-DXB11细胞的双等位基因中，一个DHFR基因被敲除，另一个DHFR基因仅包括一个错义突变（T137R），这使得此细胞不能有用复原叶酸而分解次黄嘌呤（H）和胸苷（T）。在表达外源重组卵白时，将外源的DHFR基因和方针卵白基因同时转染细胞，并经过缺少HT的培育基停止挑选。由于DHFR基因可以通太重组重排停止基因扩增，在适当的MTX压力下，可以经过DHFR基因的扩增同时获得方针卵白基因的扩增，从而获得更高表达的稳定表达细胞株。在早期CHO细胞培育时凡是需要加入血清，是以在那时的细胞挑选protocol里面经常会看到用透析血清来避免引入HT或别的核酸代谢底物。此外需要指出的是，CHO细胞平台上第一个被核准上市的tPA就是采用DXB11做为宿主细胞，而且此宿主细胞被Genentech用于后续的多个贸易化产物生产。

CHO-DG44
由于DXB11细胞中唯一一个等位基因被敲除，在持久传代进程中，会发生低几率的突变使宿主细胞重新规复DHFR基因活性，形成挑选压力的下降甚至致使重组卵白表达量的下降。是以，获得一个双等位DHFR基因完全敲除的宿主细胞成为一个需求。Chasin尝试室前后经过化学诱变和伽马射线诱变，终极在1983年挑选出了双等位DHFR基因敲除的CHO宿主细胞，并命名为CHO-DG44。虽然和DXB11都属于DHFR基因缺点型，但从谱系分枝来看，DG44和CHO-S更加接近。由于DG44细胞完全缺失了DHFR基因的活性，而且可以无血清悬浮培育，使得挑选和加压进程变得加倍有用。今朝多家公司及CDMO企业采用此细胞做为平台停止治疗性卵白的开辟，已经有多个产物进入临床及上市阶段。

CHOK1SV GS-KO
Lonza在其CHOK1SV细胞的根本上，与Cellectis 合作并操纵后者的Meganucleases技术将CHOK1SV细胞中GS的双等位基因完全敲除，于2012年推出了CHOK1SV GS-KO细胞株。由于内源性的GS基因被完全敲除，大猛进步了挑选效力，收缩了稳定细胞株的开辟周期（相比CHOK1SV系统收缩了6周），同时提升了终极克隆的稳定性。基于GS-KO细胞的GS Xceed表达平台除包括宿主细胞株外，还包括响应的质粒及V8培育基系统。GS Xceed已经在全球用于多个产物的开辟，并向全球授权（Lonza一代CHOK1SV不给中国授权）。但由于V8培育基系统相对复杂，大都CHOK1SV/GS-KO客户并未采用其培育基系统。

CHOZN GS
Merck（原SAFC）于2022年经过ECACC获得CHO-K1细胞株，并将其驯化至化学成份限制培育基CD Fusion中，然落后行亚克隆建立CHOZN CHO K1细胞系。在此细胞系根本上，经过ZFN（锌指核酸酶）技术敲除GS双等位基因，获得GS缺点型细胞株CHOZN GS，并于2012年推向市场。全部平台除细胞株外，还包括质粒、克隆构建阶段用的培育基及流加工艺平台培育基。经过平台化的培育工艺停止细胞挑选，可将稳定细胞株构建及上游工艺开辟周期缩减到18个星期。今朝以CHOZN GS做为宿主细胞的多个项目已经在全球多个国家推动光临床尝试阶段。

Others
除了上述在产业界利用较多的细胞系外，还有其他一些CHO细胞系也在利用。

如在欧洲利用比力多的Selexis公司SURE CHO-M细胞株，其源于ECACC CHO-K1细胞系，并经驯化后获得，Selexis表达平台同时应用MARs元件来提升挑选效力和方针卵白表达量，应用CHO-M的多个项目已经推动光临床尝试阶段并有一个份子获得核准上市。

Horizon的HD-BIOP1（GS Null CHO-K1）也是源于ECACC CHO-K1细胞系，经过rAAV技术将双等位GS基因敲除，获得GS缺点型细胞，但由于基因编辑尝试进程中部分尝试关键材料记录不全而引发监管机构的担忧，Horizon试图经过全基因组测序来消除监管机构的担忧，但由于基因组数据过于庞大以及现在对全部基因组数据的解读尚需光阴，今朝为止尚未在欧美国家获得临床尝试核准。

虽然可以经过度邪途径获得CHO细胞用于研讨，出格是在科研院所分歧尝试室之间的交换经常发生，但终极假如想走向贸易化利用，就要求所采用的宿主细胞必须有清楚的历史布景信息，而且尽能够简直保记录一切传代培育进程中采用的关键原材料信息，以确保细胞株的平安性。出格是当前对生命科学的领会还相当有限，即即是对于转基因食品，包括专业人士在内的分歧群体之间尚且争辩不竭，是以布景清楚且有成功进入临床或上市产物作为参考的宿主细胞更轻易获得监管机构的认可。

此外需要留意的是，虽然在研发阶段很多细胞株可免得费（或极低用度）利用，但一旦需要进入贸易化（临床尝试）阶段，均需要付出贸易化生产答应用度。下表罗列了部分细胞株的研发及贸易化授权用度形式供参考。

基因工程革新

虽然CHO细胞相对其他几种哺乳动物细胞有诸多优点，但产业界对CHO细胞更高性能的追求从未停止。今朝常用的CHO细胞尚存在一些缺点，比如：
· 较长的稳定细胞株构建周期(4+月)；
· 较低的产量(<10g/L)，形成单元生产本钱较高；
· 较长的细胞倍增时候(20+小时)；
· 多种宿主卵白对下流纯化形成压力；
· 遗传学的不稳定性，形成细胞表达量随着培育时候的耽误而下降；
· 克隆内部的异质性；
· 卵白质量(PQAs)的异质性;

这些题目标处理大多需要细胞工程学研讨来处理。如经过判定细胞基因组中的“热门”地区，并经过定点整合技术将方针基因定点整合到基因组中，进一步收缩细胞株构建周期；经过优化细胞代谢通路，提升代谢效力，提升细胞倍增速度；产量的进一步提升可以经过过表达一些卵白折叠帮助卵白等来实现；敲除对细胞发展和卵白排泄不相关的一些卵白基因，可下降宿主细胞压力，同时削减宿主卵白对下流纯化的干扰；卵白翻译后修饰在大份子药效药代进程中饰演侧重要的脚色，经过基因工程可以点窜这些修饰相关酶的表达量，来调控翻译后修饰。

今朝已经研讨的一些靶点如上图所示，其中一些靶点已经被利用到工程CHO细胞的革新。但假如计划将这些革新利用于贸易化目标，就需方法会这些革新所牵扯到的靶点，及革新进程中所利用的技术背后的常识产权题目。

结语

细胞株在全部生物制造工艺中有着相当重要的职位，一株高产、稳定的细胞株不但使得上游生产工艺变得简单，同时还能够有益于下降下流生产工艺的复杂度及全部生产工艺的本钱。是以各大制药公司均对细胞株的选用及稳定细胞株构建很是重视，而终极获得的高产稳定细胞株又是每一个在研产物的焦点资产。中国今朝还处在生物制药行业的快速起步期间，有大量的人力财力投入到这场轰轰烈烈的开辟进程中，但早期对宿主细胞株的挑选和来历并未遭到应有的重视，致使很多项目在开辟的前期才发现宿主细胞的布景信息不周全而影响项目进度，甚至不能不重新开辟，即使有些公司采纳了一定的填补手段，使得项目得以继续推动，但同时也为全部项目埋下了很大的隐患。比来两年，随着行业的慢慢成熟，大师起头普遍重视对宿主细胞的挑选，除了要求有清楚的历史布景信息外，在挑选时还要斟酌研发周期、本钱以及前期整体的生产本钱。

参考文献
1. G. Urlaub, E. Kas, A.M. Carothers, L.A. Chasin (1983), “Deletion of the diploid dihydrofolate reductase locus from cultured mammalian cells”, Cell, 33, pp. 405-412
2. Hauser, H. and R. Wagner (2022). Animal Cell Biotechnology: In Biologics Production
3. Fischer, S., R. Handrick and K. Otte (2022). “The art of CHO cell engineering: A comprehensive retrospect and future perspectives.” Biotechnol Adv 33(8): 1878-1896.

原文首发于：华人抗体协会微信公众号（chinese_antibody）