布景 临床凡是每个病人收集 > 5 mL 血液,其中总 cfDNA 含量的中位数大约为 7,500 基因组拷贝[1]。在给定 cfDNA 总量下,基于 NGS 测序的方式同时检测多个位点的突变,可以增加 ctDNA 在液体活检中的检出率,从而到达 MRD 检测要求稳定检出品貌 ≥ 0.02% ctDNA 的标准[2]。肿瘤知情测序(Tumor-informed sequencing),先对原发肿瘤构造停止周全的基因组测序获得患者变异图谱,然后定制仅靶向已知一定数目突变位点 Panel 用于 ctDNA 检测分析,可进一步提升检测的灵敏度。可是这类方式耗时长,能够还需要在极短时候里优化 Panel 设想、分解和考证,很难满足临床理论中的短周期要求。 上篇中说起的,其探针间的共轭效应使得杂交捕捉操纵更便利、稳定性等方面表示更出色。是以,我们将 μCaler® 技术上风与 MRD 检测利用处景连系,以处理传统杂交捕捉方式的痛点。 图1. μCaler® Hybrid System 工作道理 μCaler® 利用于 MRD 检测的处理计划 μCaler® MRD Solution (for Illumina®) 专为小 Panel 的靶向富集而优化设想,搭载 μCaler® Hybrid System 以及基于创新型计划设想的 μCaler® Panel,可以在单日内完成捕捉文库构建的全流程。该计划搭配含双端份子标签 (Unique Molecular Identifier, UMI) 的讨论建库,可满足 MRD 检测利用对血浆游离 DNA 超低频突变的分析要求。μCaler® Panel 是基于纳昂达自立常识产权设想推出的商品化或定制化 Panel (μCaler® Custom Panel),极速托付周期仅需 3 天。 模拟低频突变的极限检出 01 尝试设想及分析方式 样原根源:2 名健康捐献者的 gDNA 别离以 99:1、999:1 以及 9999:1 的比例夹杂获得 Tem A、Tem B、Tem C,野生模拟突变频次为 0.005%-1% 的肿瘤样本。捕捉 Panel:μCaler® Panel:3 Kb Target region,覆盖 30 个等位基因位点;Traditional Panel:42 Kb Target region (SNP Panel),覆盖 160 个等位基因位点 (包括上述 30 个位点)。 尝试计划:各模拟样天职别取 50 ng 构建含份子标签的文库,然后按 50% 比例一分为二,别离按传统杂交捕捉 NadPrep®️ Hybrid Capture Reagents和 μCaler® Hybrid System 杂交捕捉 (以下简称为 μCaler® Hyb) (图2. )。传统杂交捕捉 (以下简称为 Traditional Hyb) 因小 Panel 的脱靶率偏低,测试时额外增加了区间 (2x 设想) 并杂交 16 小时,以保证捕捉性能在最优状态。测序平台为 llumina Novaseq 6000,PE150。 数据分析:依照纳昂达份子标签分析流程,别离利用双链分歧性分析 (DCS211) 以及 单链分歧性分析 (SSCS ≥ 3) 方式,支持突变的 reads ≥1 即判定为检出。 图2. 低频突变样本模子和尝试设想 02 低频突变极限检出 在模拟样本中,理论突变频次为 1%、0.1% 以及 0.01% 的位点数目为 19 个,理论突变频次为 0.5%、0.05% 以及 0.005% 的位点数目为 11 个。当利用份子标签双链分歧性分析 (DCS211) 时,μCaler® Hyb 和Traditional Hyb 的位点均匀有用深度在 1,197x-3,593x 之间,均能有用检出全数 19 个 1% 和 11 个 0.5% 的突变位点。但对于 0.1%-0.005% 的突变位点,分歧尝试组表示出一定的差别,出现了分歧水平的漏检 (图3. 深蓝色方框)。经过模拟计较可知,当均匀测序深度为 2,750x 时,分歧突变频次下观察到一定数目突变位点的几率。图4. 横向柱形图为 10,000 次随机取样下,各突变频次检出的理论散布预期。不丢脸出,非论是 μCaler® Hyb 还是 Traditional Hyb,虽然测序深度不敷以检出全数的突变位点,但在极限条件下检测到的均匀频数是均合适预期的 (图4. 纵向柱形图)。 理论突变频次为 0.1% 和 0.01% 的位点,μCaler® Hyb 检测到的突变位点数目均匀值别离为 18.3 和 3.7,而 Traditional Hyb 的检出别离为 16.0 和 3.5 (图4. A & C);理论突变频次为 0.05% 和 0.005% 的位点,μCaler Hyb 检测到的突变位点数目均匀值别离为 9.3 和2.7,而 Traditional Hyb 检出别离为 8.0 和 2.0 (图4. B & D)。这表白 μCaler® Hyb 在这些突变频次下的位点检出率均高于 Traditional Hyb。 图3. 0.005%-1% 突变频次下,30 个模拟突变位点的检出散布 向下滑动检察 图4. 0.005%-0.1% 突变频次下,30 个模拟突变位点的检出统计 注:Observed number of mutation 为 DCS211 分析形式下,分歧突变频次检测到的均匀突变位点数目;Theoretical number of mutation 为2,750x 时,分歧突变频次做 10000 次随机取样,突变检出频数的模拟散布。 当利用份子标签单链分歧性分析 (SSCS ≥ 3) 时,可额外检测到 DCS211 分析时判定为阴性的多个位点(图3. 淡蓝色方框)。例如,理论突变频次为0.1%和0.01% 的位点,μCaler® Hyb 检测到的均匀突变位点数目别离为从 DCS211 分析形式下的 18.3 和 3.7,别离上升到 19.0 和 9.3 。虽然在其他突变频次下也可以观察到这一现象,但这类检出成果不能简单判定为阳性。由于此时对照组 (Control) 一样检出了本不应当存在的突变。这些假阳性突变是尝试进程、PCR 扩增以及测序等多个环节引入的布景“乐音“,且没法经过 SSCS ≥ 3 的形式去除。故在实在场景下,此分析方式下检出的位点需要综合辨别,以获得灵敏度和阳性猜测值间的平衡。 总结 基于 NGS 技术检测 MRD ,可检测到影象学或血清学等传统技术手段没法监测到的信号。可是漏检或错判会致使患者错过最好治疗时候大概面临过度治疗的风险,是以,在追求灵敏度的同时也要兼顾检测的阳性猜测值。μCaler® MRD Solution 在精简的操纵流程下,其性能表示照旧优于传统杂交捕捉计划,有助于临床 MRD 检测的快速展开。订购信息种别货号产物称号规格详情μCaler® MRD1100100μCaler® MRD Solution (for Illumina®), 24rxnμCaler® MRD 处理计划 (Illumina平台),24反应24 rxnUMI 讨论1103111NadPrep® UMI Adapter Kit Set A1 (with 10 nt Index), 24 rxn24 rxn# 1-121103112NadPrep® UMI Adapter Kit Set A2 (with 10 nt Index), 24 rxn24 rxn# 13-241103113NadPrep® UMI Adapter Kit Set A3 (with 10 nt Index), 24 rxn24 rxn# 25-361103114NadPrep® UMI Adapter Kit Set A4 (with 10 nt Index), 24 rxn24 rxn# 37-48 关于纳昂达科技 http://www.njnad.com/纳昂达科技秉持“ Nano Trans More ”的焦点理念和“靶向精准,专心办事诊断”的奋斗主旨,努力于为科研院校、医疗机构、临检单元、产业公司、测序办事商等供给专业化和高质量的靶向测序产物与闭环处理计划。 纳昂达科技已通太高新技术企业、江苏省科技型中小企业和南京市精准高通量测序工程技术研讨中心认定,并具有 > 2,000 平米的高通量测序研发中心和 > 4,000 平米的GMP级别 (YY/T 0287-2017 idt ISO 13485:2016) 体外诊断试剂生产基地,建立了从市场调研、产物设想、生产制造到售后办事完整的质量治理系统。 纳昂达专注于精准靶向试剂和配套自动化仪器的开辟、生产、销售和办事,今朝具有 MGI 和 Illumina 双测序平台多款 NadPrepⓇ 文库构建试剂盒和全套液相杂交相关产物。明星产物包括 NGS 全流程自动化工作站、肿瘤全外显子 Panel、泛实体瘤和血液肿瘤Panel以及呼吸道病毒 Panel 等,并供给周全完善的双平台捕捉探针定制化办事。纳昂达科技的靶向捕捉产物具有与国际同业业媲美的高质量水准,获得了客户分歧的相信。 纳昂达的销售收集覆盖全国并已外延至外洋地域。纳昂达将与客户共长大,对客户的需责备力以赴,为全球用户供给靶向测序处理计划和 IVD 试剂质料。 Nanodigmbio 电话:400 871 7699邮箱:sales@njnad.com 网址:http://www.njnad.com 参考文献[1] Van Der Pol Y, Mouliere F. Toward the early detection of cancer by decoding the epigenetic and environmental fingerprints of cell-free DNA[J]. Cancer cell, 2019, 36(4): 350-368.[2] 《肺癌 MRD 的检测和临床利用共鸣》 |
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